Die Transfer-RNA liefert die passenden Aminosäuren, um während der Translation von der DNA abgelesene Sequenzen in Polypeptidketten umzuwandeln.
Sie besitzt die Andockstellen für genau drei Basen, die jeweils genau passend für eine Aminosäure sind. Diese zur mRNA komplementären Basentripletts werden als Anticodons bezeichnet, die Basenabfolgen, die eine spezielle Aminosäure codieren, nennt man den genetischen Code.
Die tRNA sammelt innerhalb der Zelle die passende Aminosäure ein und transportiert sie ins Ribosom, wo ein zu ihrem Anticode passendes Basentriplett gesucht wird. Dort dockt sie an und die mitgebrachte Aminosäure wird mittels Peptidbindung an die benachbarte Aminosäure angeknüpft, die von einer anderen tRNA gebracht wurde. So entsteht nach und nach eine lange Kette von Peptiden, während das Ribosom immer ein Codon weiter rückt, bis es zu einem Stoppcodon gelangt, z. B. UGA. Zu dieser Sequenz gibt es keine passende Aminosäure, so dass hier die Translation stoppt und die Peptidkette sich endgültig vom Ribosom löst.
Die Synthese der vergleichsweise kleinen tRNA findet ebenfalls im Zellkern statt, da sie auch von der DNA abgelesen werden muss (durch die RNA-Polymerase III), und zwar vom sogenannten ’RNA-Gen’. Anschließend wird auch hier posttranskriptional modifiziert. Die tRNA ist genau wie die rRNA eine nicht-codierende (non-coding) RNA, da sie keine Erbinformation trägt.