Phosphatasen spalten durch Wassereinlagerung (Hydrolyse) aus Phosphorsäureestern oder Polyphosphaten Phosphorsäure ab. Sie führen die reverse Reaktion einer Kinase durch.
Die bekanntesten Vertreter dieser Gruppe sind die nach ihrem pH-Optimum benannten Enzyme saure Phosphatase und alkalische Phosphatase. Am häufigsten sind die nukleinsäurespaltenden Nukleasen, die DNA oder RNA depolymerisieren, d. h. in Bruchstücke zerlegen.
Protein-Phosphatasen entfernen die von Proteinkinasen an Aminosäurereste (zumeist Serin, Threonin und Tyrosin) angehefteten Phosphatreste. Beides, die Phosphorylierung und Dephosphorylierung, sind wichtige Komponenten der Signalweiterleitung.