Mega, Crispr, Finger? Die Techniken des Genome Editings

Unter dem Begriff Genome Editing werden derzeit zwei neue molekularbiologische Systeme zusammengefasst, die Mutationen an einzelnen Erbgutbausteinen gezielt herbeiführen: (1) die Oligonukleotid gerichtete Mutagenese und (2) die ortsspezifische Nuklease (site directed nucleases; SDN). Beide zielen darauf ab eine Änderung in der DNA-Sequenz herbeizuführen.

Mutationen können mittels Genome Editing erzeugt werden. Bildquelle: GENOMXPRESS SCHOLÆ 6

Bei der Oligonukleotid gerichteten Mutagenese wird ein kurzer veränderter DNA-Abschnitt genutzt, welcher sich an einer oder wenigen Stellen von der Zielsequenz unterscheidet, um an einer definierten Stelle eine Mutation im Erbgut zu induzieren (Punktmutation).

Die ortsspezifischen Nukleasen bestehen aus zwei Elementen. Ein Element des Systems erkennt die zu verändernde Erbgutsequenz, ein zweites schneidet das Erbgut an eben dieser Stelle. Es gibt vier sich ähnelnde Systeme ortsspezifischer Nukleasen: die Meganukleasen, die Zink-Finger-Nukleasen (ZFN), Transcription Activator Like Effector Nukleasen (TALEN) und das Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR associated Systems (CRISPR/Cas System).

Die Reparatur der durch die neuen Techniken erzeugten Brüche orientiert sich dabei an den natürlichen molekularen Reparaturmechanismen der Zelle, die zum Beispiel Fehler beim Kopieren von Erbgut in den Zellen beheben. So können einzelne Bausteine des Erbguts ausgeschnitten oder neu kombiniert werden. Bedingt durch die zelleigenen Systeme können so auch einzelne Bausteine hinzufügt werden, ähnlich wie bei natürlichen oder induzierten Mutationen durch Chemikalien oder Bestrahlung. Allerdings besteht ein gravierender Unterschied darin, dass die Veränderungen nicht wie bei Mutationszucht ungerichtet erfolgen, sondern gezielt an gewollten Stellen.

Die Funktion des Genome Editing lässt sich in drei Schritten beschreiben:

Es werden Lotsen (guides) genutzt, wie DNA/RNA-Abschnitte oder Proteine, welche die zu verändernde Erbgutsequenz erkennen.
Die zu verändernde Sequenz wird von speziellen Proteinen, den ortsspezifischen Nukleasen, geschnitten (nur bei ortsspezifischen Nukleasen).
Der Schnitt oder die Fehlpaarung wird durch natürliche zelleigene Systeme repariert.

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Oligonukleotid gerichtete Mutagenese

Die Oligonukleotid gerichtete Mutagenese (ODM) kann unterschiedlich aufgebaut sein. Häufig bestehen die Oligonukleotide (kurze Nukleinsäurestücke aus 20 bis 70 Nukleotiden) aus einer Mischung von RNA und DNA Bausteinen aber auch künstlich veränderte Bausteine können Teil eines Oligonukleotids sein.

Das in die Zelle eingebrachte Oligonukleotid passt sehr genau zu einer bestimmten DNA-Sequenz des Genoms, die verändert werden soll. Es unterscheidet sich nur in ein bis vier Nukleotiden von dieser Sequenz. Ein Nukleotid besteht aus einer Nukleotidbase, einem Zucker und einer Phosphatgruppe.

Das eingebrachte Oligonukleotid bindet direkt an die passende DNA-Sequenz des Genoms und bildet an der abweichenden Stelle eine stabile Fehlpaarung. Diese wird über den zelleigenen Mechanismus der Fehlpaarungsreparatur korrigiert. Dadurch kommt es in einigen Fällen zu einer gezielten Veränderung an genau der gewünschten Stelle im Genom.

Ortsspezifische Nukleasen

Beim Einsatz von ortspezifischen Nukleasen zur Erzeugung eines Bruchs in der DNA wird das schneidende Enzym über einen fusionierten Proteinteil an den Zielort dirigiert (zutreffend für Mega-, Zink-Finger- und TALE-Nukleasen). Dort bindet der Proteinteil an eine spezifische DNA-Sequenz. Alternativ zu der Protein vermittelten Bindung, bewirkt im Fall von CRISPR/Cas9 eine kurze RNA-Sequenz, die sogenannte single guide RNA, diese spezifische Bindung an den Zielort. Nach der Bindung an die DNA wird ein Doppelstrangbruch in der DNA erzeugt, der anschließend über zelleigene Reparaturwege repariert wird.

Es gibt zwei Reparaturwege. In den meisten Fällen wird der Doppelstrangbruch über die nicht homologe Endverknüpfung (non homologous end joining; NHEJ) repariert. Dieser Weg führt oftmals zu Fehlern und somit zu geringen Veränderungen im Genom (Mutation). Die Art der entstandenen Mutation ist nicht vorherbestimmt und kann neben Insertionen und Deletionen unterschiedlicher Länge auch Substitutionen beinhalten. Wird eine bestimmte Veränderung beabsichtigt, dann ist es notwendig die gewünschte Mutation durch die Zugabe einer DNA-Reparatur-Matrize (Vorlage) zu steuern.

In selteneren Fällen erfolgt die Reparatur mittels homolog gerichteter Reparatur (homology directed repair). Hierfür werden zusätzlich DNA-Sequenzen benötigt, die identisch zu der Sequenz im Bruchbereich sind. Dieser Reparaturweg ist in der Regel fehlerfrei und kann gezielt genutzt werden, um zusätzliche DNA-Sequenzen einzufügen (gene targeting).

Die Präzision des Genome Editing entsteht also durch die sehr spezifische Bindung an eine vorher ausgewählte Sequenz im Genom. Fast ausschließlich an dem ausgewählten Ort kommt es zu der beschriebenen Induktion von Veränderungen. Nebeneffekte treten je nach Auswahl der Erkennungssequenz selten bis gar nicht auf.

Meganukleasen

Meganukleasen sind natürlicherweise in Bakterien, Hefen und Algen vorkommende Endonukleasen. Endonukleasen sind Enzyme, die Erbgutsequenzen erkennen und schneiden. Durch eine Veränderung des Erkennungselements lassen sich jeweils neue Erbgutsequenzen ansteuern. Da die beiden Elemente DNA-Sequenzen zu erkennen und zu schneiden nicht getrennt voneinander vorliegen, kann sich die Veränderung des DNA-Erkennungselements auch auf die Fähigkeit das Erbgut zu schneiden auswirken. Dadurch sind das Design und die Konstruktion der Meganukleasen schwierig.

Zink-Finger-Nukleasen (ZFNs)

Eine Zink-Finger-Nuklease besteht aus zwei getrennten Elementen. Das erste Element, bestehend aus einem Protein mit mehreren Zinkfingerstukturen, erkennt spezifisch die zu verändernde Erbgutsequenz in Blöcken von drei Basen. Das zweite Element, eine unspezifische künstlich angehängte Nuklease, schneidet die DNA. Da die Nuklease nur als Paar schneidet sind immer zwei Zink-Finger-Nukleasen nötig um eine Sequenz im Erbgut anzusteuern und zu schneiden.

Transcription Activator Like Effector Nukleasen (TALEN)

Die TALEN sind den Zink-Finger-Nukleasen sehr ähnlich. Auch sie bestehen aus zwei getrennten Elementen: Das eine erkennt die zu verändernde Erbgutsequenz und das zweite, die Nuklease, schneidet diese. Auch TALEN funktionieren nur als Paar. Der Unterschied zwischen ZFN und TALEN liegt in der Erkennung der Basen: Das Erbgut wird nicht in dreier Blöcken erkannt, sondern jede Base einzeln. Der Vorteil gegenüber ZNF besteht darin, dass sich die TALEN viel spezifischer anpassen lassen als die ZFN.

CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/ (CRISPR associated) Cas-Systeme

Ähnlich wie bei ZFN und TALEN bestehen auch CRISPR-Systeme aus zwei Elementen: Eines erkennt die Erbgutsequenz (CRISPR-RNA), und eine zweites schneidet diese (Cas Nuklease). Der Unterschied zu TALEN und ZFN besteht darin, dass für die Erkennung im CRISPR-System eine kurze RNA anstelle von Proteinen genutzt wird. Diese RNA, die guide RNA, kann je nach Zielsequenz frei synthetisiert werden. Die schneidende Cas Nuklease bleibt hingegen unverändert. Das macht das System einfacher, flexibler und durch den einfachen Aufbau auch kostengünstiger. CRISPR-Systeme arbeiten allein und benötigen keine Paarbildung, um die DNA zu schneiden.

Nachdem das CRISPR/Cas Systeme sein Zielsequenz gefunden und geschnitten hat, kann es passieren, dass es nach weiteren passenden DNA-Abschnitten sucht und sehr ähnliche Sequenzen schneidet. Diese nennt man "Off-Target Effekte". Wie man solche verfehlten Ziele im Genom findet erklärt Dominik Modrezjewski im Genome Editing Kantinengespräch.