Endonukleasen sind Nukleasen die bestimmte DNA-Sequenzen spezifisch erkennen und schneiden können. Im Gegensatz zu Exonukleasen schneiden Endonukleasen in der Mitte eines DNA-Moleküls.
Restriktionsenzyme (auch Restriktionsendonukleasen genannt) erkennen die Schnittstelle in der DNA meist anhand von einer Palindromsequenz.
Weitere Besipiele von Endonukleasen sind Cas9, Zinkfingernukleasen oder TALENs.
Aufgrund ihrer Fähigkeit, DNA spezifisch zu erkennen und zu schneiden, finden Endonukleasen Anwendung in der Biotechnologie und Molekularbiologie.