Sequenzierung - Kettenabbruchsynthese nach Sanger

Lexikon


Die sogenannte Kettenabbruchsynthese, die 1975 vom britischen Biochemiker Frederick Sanger erfunden wurde, bildet auch heute noch häufig die Grundlage moderner Sequenzierungstechniken. Zusammen mit Gilbert erhielt Sanger dafür im Jahr 1980 den Nobelpreis für Chemie.

Seine Methode beruht hauptsächlich auf einer enzymatischen Reaktion. Das zu sequenzierende, doppelsträngige DNA-Molekül (Doppelhelix) wird zunächst durch Hitze in die zwei Einzelstränge gespalten (denaturiert). Ausgehend von einem kurzen Abschnitt bekannter Sequenz, dem so genannten Primer, der sich an einen Einzelstrang anlagert und so ein kurzes Stück Doppelstrang bildet, verlängert das Enzym DNA-Polymerase den fehlenden der beiden komplementären DNA-Stränge.

In vier sonst gleichen Ansätzen (alle beinhalten die vier Nukleotide) wird je eine der vier Basen zum Teil als Didesoxynukleosidtriphosphat (ddNTP) zugegeben. Diese Kettenabbruch-ddNTPs besitzen keine 3’-Hydroxylgruppe, die für die Verknüpfung mit dem nächsten Nukleotid unbedingt notwendig ist. Es kommt an dieser Stelle im neusynthetisierten Strang zu einem Kettenabbruch. In der Folge entstehen DNA-Fragmente unterschiedlicher Länge, die in jedem separaten Ansatz stets mit dem gleichen ddNTP enden. Entweder der Primer oder die ddNTPs sind radioaktiv markiert.

Nach der Sequenzierung werden alle Fragmente mittels Gel-Elektrophorese der Länge nach aufgetrennt. Durch Vergleich der vier Ansätze kann die Sequenz nach der Entwicklung des radioaktiven Gels auf einem fotografischen Film abgelesen werden.

Seit Anfang der neunziger Jahre werden die radioaktiven Substanzen durch Fluoreszenz-Farbstoffe ersetzt. Jedes der vier ddNTPs wird dabei mit einem unterschiedlichen Farbstoff gekoppelt. Diese Modifikation erlaubt es, alle vier ddNTPs in einem Reaktionsgefäß zuzugeben.

Mittels Kapillarelektrophorese werden die entstandenen Kettenabbruchprodukte aufgetrennt und durch einen Laser zur Fluoreszenz angeregt. Die Fluoreszenfarbstoff-gekoppelten ddNTPs am Ende jedes DNA-Fragmentes zeigen dadurch Fluoreszenz unterschiedlicher Farbe und können so von einem Detektor erkannt werden. Das Chromatogramm (die Abfolge der Farbsignale, die am Detektor erscheinen) gibt direkt die Sequenz der Basen des sequenzierten DNA-Stranges wieder.