Restriktionsenzyme, genauer Restriktionsendonukleasen, sind bakterielle Enzyme, welche DNA an bestimmten Positionen schneiden können.
Restriktionsendonukleasen kommen natürlich vor und werden von Bakterien zur Phagenabwehr genutzt.
In der Molekularbiologie werden diese Enzyme verwendet, um DNA-Moleküle definiert zu schneiden. Daher werden diese Enzyme auch als „molekulare Scheren“ bezeichnet. Jede Restriktionsendonuklease erkennt eine spezifische DNA-Basensequenz. Die Spezifizität ist jedoch nicht perfekt. Aktivität außerhalb der Spezifikation nennt man Star-Aktivität.